ИФА (ELISA) на микропланшетном ридере: практическое руководство

Иммуноферментный анализ (ИФА, англ. ELISA — Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) — один из самых распространённых методов лабораторной диагностики. На нём построены тесты на инфекции, гормоны, аутоантитела, онкомаркеры и аллергены. Финальный этап ИФА — измерение оптической плотности окрашенного продукта реакции в каждой лунке планшета, и здесь ключевую роль играет микропланшетный спектрофотометр. В этом материале разберём принцип метода и практику работы на планшетном ридере. О выборе самого прибора читайте в статье как выбрать планшетный ридер.

Принцип иммуноферментного анализа

В основе ИФА лежит специфичное связывание антигена и антитела, к которому присоединён фермент (чаще всего пероксидаза хрена HRP или щелочная фосфатаза). После добавления субстрата фермент катализирует цветную реакцию: интенсивность окраски пропорциональна количеству искомого вещества. Реакцию останавливают стоп-раствором (обычно серная кислота), после чего планшет считывают на ридере абсорбции.

Форматы ИФА

Существует несколько основных схем постановки анализа:

• Прямой ИФА — меченный ферментом антиген или антитело связывается напрямую с мишенью. Прост, но менее чувствителен.
• Непрямой ИФА — первичное антитело связывается с антигеном, затем добавляется меченное вторичное антитело. Выше чувствительность, применяется в серологии.
• Сэндвич-ИФА — антиген захватывается между двумя антителами (захватывающим и детектирующим). Самый специфичный формат для определения белков и гормонов.
• Конкурентный ИФА — искомое вещество конкурирует с меченым аналогом за связывание; сигнал обратно пропорционален концентрации. Применяется для малых молекул (гаптенов).

Выбор длины волны на ридере

Большинство ИФА-наборов на основе HRP с субстратом TMB считывают при 450 нм после остановки реакции. Для повышения точности используют референсную длину волны (620, 630 или 650 нм): из основного сигнала вычитают оптические артефакты планшета и царапины. Наборы на щелочной фосфатазе с субстратом pNPP считывают при 405 нм. Монохроматорный ридер удобен тем, что любую из этих длин волн можно выбрать программно без замены фильтров.

Совет: всегда задавайте в протоколе и основную, и референсную длину волны (например, 450/620 нм) — это заметно снижает разброс результатов.

Построение калибровочной кривой

Количественный ИФА требует калибровки по стандартам известной концентрации. Для нелинейной зависимости сигнал–концентрация применяют 4-параметрическую (4PL) или 5-параметрическую (5PL) логистическую модель — линейная аппроксимация для ИФА, как правило, непригодна. Современное ПО ридеров (SkanIt, Gen5, MARS) строит эти кривые автоматически и сразу выдаёт концентрации проб.

Типичные ошибки и как их избежать

Качество результатов ИФА зависит не только от прибора, но и от техники постановки:

• Краевой эффект (edge effect) — лунки по периметру планшета прогреваются иначе; используйте термостатируемый ридер и не оставляйте периметр под стандарты.
• Неполная промывка — остатки конъюгата дают высокий фон; соблюдайте число циклов промывки.
• Пузырьки воздуха в лунках — искажают оптическую плотность; перед считыванием удаляйте пузырьки и применяйте встряхивание.
• Просроченный субстрат TMB — приводит к слабому сигналу; храните реактивы по инструкции.
• Считывание не в линейном диапазоне — если оптическая плотность выходит за 2,0–3,0 OD, разведите пробы.

Частые вопросы

Оборудование для ИФА от KombiMED

KombiMED GmbH поставляет микропланшетные спектрофотометры и мультимодовые ридеры для ИФА от ведущих европейских и мировых производителей. Поможем подобрать прибор под ваши наборы, организуем поставку, монтаж и обучение. Ознакомьтесь с моделями в каталоге и свяжитесь с нашей командой.